Méthodes d'analyse des prot.

[Karima]

Bonjour
Pourquoi deux protéines aux points isoélectriques différents (prenons une protéine A ayant un PI supérieur à une autre protéine B) ne peuvent pas s'associer pour former les deux sous-unités d'une protéine dimérique ?
Autrement dit, pourquoi les protéines A et B ne peuvent pas s'associer pour former les deux sous-unités d'une protéine dimérique ?
Les histones sont dans le culot d'une centrifugation 10 000g 10 minutes ? C'est pas sensé être à l'intérieur du noyau et accroché à l'ADN ? Du coup ce serait pas plutôt dans le culot d'une centrifugation haute vitesse 150 000g -3heures ?
En quoi l'électrophorèse bidimensionnelle peut servir d'étape préparatoire à une analyse par spectrométrie de masse ?
Pourquoi l'électrophorèse bidimensionnelle est influencée par l'état de phosphorylation des protéines ?
On peut vraiment parler de protéine eucaryote et procaryote ? Depuis quand une protéine a un noyau ? Ce sont les cellules qui en ont non, et les protéines sont des constituants des cellules ? (enfin, on en a dedans quoi)
Dans l'électrophorèse bidimensionnelle, dans la deuxième dimension, on aura bien une séparation des protéines sous-unités - dépendantes ? Plus y en aura, plus le PM de la prot sera élevé du coup elle migrera moins facilement vers la borne +.
Le taux de structures secondaires n'intervient pas dans la séparation des protéines par électrophorèse bidimensionnelle Le taux, ça veut dire quoi ça ? La proportion de X et Y structures secondaires dans une même protéine ?
Pourquoi les premières protéines qui sortent dans les toutes premières fraction (dans le cas d'une C par échange d'ions dont phase fixe composée billes chargées négativement) sont celles qui ont le PI le plus faible ? OK le PH de la phase d'élution doit être supérieur au PI de la protéine en question pour que ça descende du coup plus le PI est petit et plus on a de chances d'avoir une protéine chargée négativement ? (c'est ça le raisonnement à avoir ?)
Si le PI (prot) est inférieur au PH de la phase d'élution alors la protéine est chargée négativement ? Et inversement, positivement ? Une protéine analysée par chromatographie par filtration sur gel nous permettra toujours de bien déterminer la masse molaire de la protéine de façon sûre ?

Je remercie d'avance le super-tuteur qui va répondre à tout ça !

[Raf]

Bonjour!

Pourquoi deux protéines aux points isoélectriques différents (prenons une protéine A ayant un PI supérieur à une autre protéine B) ne peuvent pas s'associer pour former les deux sous-unités d'une protéine dimérique ?

Ou est-ce que tu as vu ça?

Les histones sont dans le culot d'une centrifugation 10 000g 10 minutes ? C'est pas sensé être à l'intérieur du noyau et accroché à l'ADN ? Du coup ce serait pas plutôt dans le culot d'une centrifugation haute vitesse 150 000g -3heures ?

Les histones sont dans le noyau et le noyau se trouve dans le culot après centrifugation à basse vitesse 1000g, 10 min. Donc les histones se trouvent bien dans le culot d'une centrifugation basse vitesse!

En quoi l'électrophorèse bidimensionnelle peut servir d'étape préparatoire à une analyse par spectrométrie de masse ?

L'analyse par spectrométrie de masse permet d'analyser une protéine purifiée, l'électrophorèse bidimensionnelle permet justement de purifier cette protéine en l'isolant de toutes les autres en fonction de son pI et de son poids moléculaire.

Pourquoi l'électrophorèse bidimensionnelle est influencée par l'état de phosphorylation des protéines ?

La phosphorylation d'une protéine, tu le verras en bio cell, c'est quand un phosphate a été rajouté sur la protéine. Comme elle a un phosphate de plus, son poids moléculaire est modifié donc elle ne migrera pas au même endroit lors d'une électrophorèse

On peut vraiment parler de protéine eucaryote et procaryote ? Depuis quand une protéine a un noyau ? Ce sont les cellules qui en ont non, et les protéines sont des constituants des cellules ? (enfin, on en a dedans quoi)

Ou as tu vu ça? Je pense que c'était plutôt pour faire allusion à une protéine propre à une cellule eucaryote et une protéine propre à une celle procaryote. Sinon, ne t'inquiète pas, une protéine c'est juste une molécule, c'est tout petit par rapport à une cellule et ça n'a pas de noyau

Dans l'électrophorèse bidimensionnelle, dans la deuxième dimension, on aura bien une séparation des protéines sous-unités - dépendantes ?

Ouaip, dans la 2e dimension, le SDS a été ajouté. Le SDS homogénéise les charges, donc c'est bien par rapport au poids moléculaire et non plus au pI que les molécules vont migrer. Le SDS rompt aussi les liaisons faibles, donc les différentes sous unités de la protéine qui étaient liées entre elles par des liaisons faibles seont séparées et migreront différement selon leur poids moléculaire. Plus une sous unité aura un PM élevé, moins elle migrera loin. Ce n'est pas forcément le PM de la protéine entière qui entrera en jeu, mais le PM de chaque sous unité.

Le taux, ça veut dire quoi ça ? La proportion de X et Y structures secondaires dans une même protéine ?

C'est ça, c'est le nombre d'hélice alpha, de feuillet bêta .... qu'il y a dans la protéine

Pourquoi les premières protéines qui sortent dans les toutes premières fraction (dans le cas d'une C par échange d'ions dont phase fixe composée billes chargées négativement) sont celles qui ont le PI le plus faible ? OK le PH de la phase d'élution doit être supérieur au PI de la protéine en question pour que ça descende du coup plus le PI est petit et plus on a de chances d'avoir une protéine chargée négativement ? (c'est ça le raisonnement à avoir ?)
Si le PI (prot) est inférieur au PH de la phase d'élution alors la protéine est chargée négativement ? Et inversement, positivement ?

J'aime bien quand tu réponds toi même aux questions ^^
Mais oui c'est ça tout est bon

Une protéine analysée par chromatographie par filtration sur gel nous permettra toujours de bien déterminer la masse molaire de la protéine de façon sûre ?

La chromatographie par filtration sur gel te permettra de déterminer quelles sont les molécules les plus petites et les plus grosses, pas besoin d'en savoir plus!
Pour obtenir avec une très grande précision la masse d'une protéine, il faut utiliser la spectrométrie de masse.

Si tu as encore des points qui ne sont pas clairs ou que j'ai mal expliqué quelque chose, n'hésite pas à reposer des questions!

[Etienne Lamare]

Bonjour
Pourquoi deux protéines aux points isoélectriques différents (prenons une protéine A ayant un PI supérieur à une autre protéine B) ne peuvent pas s'associer pour former les deux sous-unités d'une protéine dimérique ?
Autrement dit, pourquoi les protéines A et B ne peuvent pas s'associer pour former les deux sous-unités d'une protéine dimérique ?
Les histones sont dans le culot d'une centrifugation 10 000g 10 minutes ? C'est pas sensé être à l'intérieur du noyau et accroché à l'ADN ? Du coup ce serait pas plutôt dans le culot d'une centrifugation haute vitesse 150 000g -3heures ?
En quoi l'électrophorèse bidimensionnelle peut servir d'étape préparatoire à une analyse par spectrométrie de masse ?
Pourquoi l'électrophorèse bidimensionnelle est influencée par l'état de phosphorylation des protéines ?
On peut vraiment parler de protéine eucaryote et procaryote ? Depuis quand une protéine a un noyau ? Ce sont les cellules qui en ont non, et les protéines sont des constituants des cellules ? (enfin, on en a dedans quoi)
Dans l'électrophorèse bidimensionnelle, dans la deuxième dimension, on aura bien une séparation des protéines sous-unités - dépendantes ? Plus y en aura, plus le PM de la prot sera élevé du coup elle migrera moins facilement vers la borne +.
Le taux de structures secondaires n'intervient pas dans la séparation des protéines par électrophorèse bidimensionnelle Le taux, ça veut dire quoi ça ? La proportion de X et Y structures secondaires dans une même protéine ?
Pourquoi les premières protéines qui sortent dans les toutes premières fraction (dans le cas d'une C par échange d'ions dont phase fixe composée billes chargées négativement) sont celles qui ont le PI le plus faible ? OK le PH de la phase d'élution doit être supérieur au PI de la protéine en question pour que ça descende du coup plus le PI est petit et plus on a de chances d'avoir une protéine chargée négativement ? (c'est ça le raisonnement à avoir ?)
Si le PI (prot) est inférieur au PH de la phase d'élution alors la protéine est chargée négativement ? Et inversement, positivement ? Une protéine analysée par chromatographie par filtration sur gel nous permettra toujours de bien déterminer la masse molaire de la protéine de façon sûre ?

Je remercie d'avance le super-tuteur qui va répondre à tout ça

Si tu pouvais aérer un peu ton message la prochaine fois, ça serait gentil

[Karima]

Merci beaucoup
Je reposterai sûrement quand je bosserai la Bioch x)

Et je penserai à aérer bien-sur

[eliserr]

N'hésite surtout pas !

Bon courage ♥

[Jcli]

Les questions posées viennent des QCM "d'entraînement" donné par le prof ^^

Moi j'aurai juste une question, je vous l'envoie comme on nous la présente !

Question 13 de 15 0.67/ 1.0 Points
On soumet les protéines de la bactérie E. Coli à une électrophorèse bidimensionnelle (voir figure ci-dessous). Deux protéines A et B sont extraites et analysées. Indiquer parmi les propositions suivantes celle(s) qui est (sont) exacte(s) : (Concours 2010)

A. Le poids moléculaire de la protéine A est plus grand que celui ce la protéine B.
B. Le point isoélectrique de la protéine A est plus élevé que celui de la protéine B.
C. Les protéines A et B ont toutes les deux une charge globale positive à pH 9.
D. Le rapport du nombre de chaînes latérales acides sur le nombre de chaînes latérales basiques est plus grand dans la protéine A que dans la protéine B.
E. Les deux protéines A et B pourraient éventuellement constituer les deux sous-unités d’une protéine dimérique.


Apparemment les réponses sont A, D et E

Et j'ai du mal à comprendre la E en fait, parce que les protéines sont d'abord soumises à l'électrofocalisation non ? Du coup si elles faisaient parties d'une même protéine multimérique, on devrait pas les retrouver sur une même "colonne" ? Puisqu'au départ le pI de la protéine (avec les deux sous unités) est unique, et seulement après avec ajout du SDS, on sépare les sous unités par leur poids moléculaire ?
Ou est-ce que les migrations sur les deux dimensions se font en même temps ?
Ce qui permettrait d'avoir une séparation en "diagonale" des sous unités... Hmm ?
Ou encore est-ce que ça sous entends qu'on peut utiliser du Betamercapto avant ?

Merci d'avance ! =D

[eliserr]

Hum... il va nous falloir l'image...
(on risque de ne pas te répondre ce week-end, n'hésite pas à nous relancer !)

[Jcli]

C'est bizarre chez moi elle s'affiche pourtant
J'ai rajouté le lien en URL ^^

Okay ! C'est pas pressé de toute façon =)

[eliserr]

Ca y est ça s'affiche
Et euuh... Humpf... J'me renseigne auprès de mon poly, si tu ne vois rien venir relance à nouveau !

[cpoulain2001]

Alors j'ai eu le problème j'ai demandé à mon prof d'ED réponse :
Avec ce qu'on vous a dit dans cours se n'est pas possible !!
Donc il y a une coquille dans les correction sakai !