QCM, Immunofluorescence cytosquelette

[hocine]

Bonjour,

je ne comprends pas pourquoi l'item A est vrai, sommes-nous obligé de perméabiliser la cellule avant de l'étudier par immunofluorescence ?
Je sais que lorsqu'une cellule meurt on ne peut plus étudier sa dynamique mais du coup, avec l'immunofluorescence on ne peut pas étudier la dynamique d'une cellule ?

Merci d'avance

[Alpha Chris]

Salut à toi !
Je me permets de te faire un rapide petit rappel sur l'immunofluorescence !
L’immunofluorescence est une technique de marquage qui permet de localiser des protéines. Elle ne sera donc pas utilisée pour observer la dynamique cellulaire.
Cette technique utilise des anticorps spécifiques à la molécule qui veut être observée.
Et pour permettre à l'anticorps de se fixer sur la molécule, tu es d'accord qu'il doit au préalable être présent dans la cellule.
Donc, on doit tout d'abord perméabiliser la cellule(faire un trou) pour injecter notre anticorps, et une fois perméabilisée, la cellule est fixé elle est donc morte.
Cette méthode peut être réalisée de deux façons :
- De manière directe : l'anticorps qui va être injecté possède lui-même la molécule fluorescente et va aller se fixer sur l'antigène considéré (la protéine que l'on veut observer).
- De manière indirecte : l'anticorps injecté va aller se fixer sur l'antigène considéré sauf que cette fois-ci, il ne possède pas de molécule fluorescente. Et c'est un second anticorps (anticorps secondaire) qui lui est marquée, qui va aller se fixer sur notre anticorps primaire. Le signal sera donc amplifié !
Attention, il faut que notre anticorps primaire soit produit dans une autre espèce que celle que l'on cherche à étudier et que notre anticorps secondaire soit produit chez une espèce différente de celle de l'anticorps primaire !
Voilà, j'espère que j'ai réussie à t'éclairer sur ce point là !
Quand tu as un doute sur une méthode d'observation, n'hésites pas à te référer sur le chapitre d'introduction avec la microscopie.
Et n'hésites surtout pas à pauser d'autres questions en cas de besoin.
Bon courage !

[hocine]

Merci beaucoup, c'est beaucoup plus clair !

Juste, une question, c'est qu'un détail mais l'anticorps primaire ne peut pas être de la même espèce que l'espèce étudiée et l'anticorps secondaire ne peut pas être de la même espèce que l'anticorps primaire mais est-ce que l'anticorps secondaire peut être de la même espèce que l'espèce que l'on cherche à étudier ?
C'est peut-être bête comme question mais elle me trotte dans la tête depuis le début haha.

Merci d'avance !

[Alpha Chris]

Coucou !
Alors, dans les faits, on peut avoir deux fois la même espèce ! Si l'on se réfère au mode d'action d'un anticorps, celui-ci doit obligatoirement être différent de l'espèce sur laquelle il va se fixer pour qu'il la reconnaisse comme "un ennemi", un élément externe à la cellule et donc qui doit être éliminé. Parce qu'on se rappelle que l'une des fonctions principales d'un anticorps est l'immunité !
Sachant que l'anticorps secondaire ne se fixe que sur l'anticorps primaire, il doit seulement reconnaître cet anticorps comme étant externe à lui même, mais il n'a pas vraiment besoin de reconnaître les organites de la cellules comme étant différents de lui-même, parce qu'il n'a pas à se fixer dessus tout simplement.
Maintenant, le prof insiste sur le fait que ça doit être 3 espèces différentes sinon, on a pas assez d'immunogenicité justement !
Ce qu'il est surtout important de retenir c'est que l'anticorps primaire doit provenir obligatoirement d'une autre espèce de l'antigène, et l'anticorps secondaire d'une autre espèce de l'anticorps primaire ! Mais on utilisera généralement trois espèces différentes pour éviter toute ambiguïté aux étudiants.

[hocine]

En fait dans les faits, on peut mais on ne le fait pas pour éviter toute ambiguïté, comme tu dis.
Merci beaucoup, tes explications sont très claires !

[Alpha Chris]

Oui, exactement ! On se réfère toujours sur le cours du prof !
Je t'en prie

[BenC]

Bonsoir,

J'ai juste un petit doute et je pense que c'est pas très clair de mon côté pour l'anticorps/antigène en immunofluorescence,

''Attention, il faut que notre anticorps primaire soit produit dans une autre espèce que celle que l'on cherche à étudier et que notre anticorps secondaire soit produit chez une espèce différente de celle de l'anticorps primaire !''

Tout d'abord, un anticorps n'est pas justement spécifique à un seul type d'antigène? Donc dans ce cas, ne devrait il pas JUSTEMENT être produit contre l'espèce qu'on cherche à étudier pour se fixer? Et je sais plus si c'est vraiment indiqué dans le cours mais pourquoi faudrait il que l'anticorps secondaire soit différente de l'anticorps primaire? Que se passe il concrètement si c'est l'anticorps primaire qui soit produit dans la MEME espèce que celle qu'on cherche à étudier et que se passe t'-il si l'anticorps secondaire soit produit chez la même espèce primaire? Je me suis jamais posé la question en soit jusqu'à que je tombe sur ce topic x)

[Alpha Chris]

Salut !
Alors, il faut bien savoir distinguer le rôle de l'anticorps et de l'antigène dans l'organisme et leur mode de fonctionnement.
Je vais faire un petit rappel sur l'immunité !
Dans l'organisme on a le soi, qui est l'ensemble des molécules appartenant à cet organisme, et le non-soi, ensemble des substances extérieures à cet organisme.
Un antigène est par définition une molécule étrangère à un organisme, elle appartient au non-soi, et l'organisme va donc vouloir l'éliminer.
Un anticorps est lui est une protéine produite par l'organisme (lymphocytes B) qui va aller reconnaître l'antigène et se fixer dessus.
L'anticorps est composé de quatre chaines : deux chaines lourdes et de deux chaines légères. Il faut savoir que ce sont en fait des séquences d'acides aminés.
Cet anticorps est constitué d'une zone variable qui va permettre la reconnaissance de l'antigène, et c'est cette partie qui sera différente d'un anticorps à un autre. Elle est spécifique à l'antigène considéré, ce qui permet à un anticorps d'être propre à un seul antigène !
Donc, c'est parce que ces chaînes sont propres à l'antigène qu'elles vont le reconnaître et ainsi se fixer dessus!
L'anticorps est aussi constitué d'une zone constante, qui est identique pour chaque anticorps, et qui sera reconnue par les macrophages (rôle dans la phagocytose).
Je te joints en pièces jointes le schéma descriptif d'un anticorps.

Tout d'abord, un anticorps n'est pas justement spécifique à un seul type d'antigène? Donc dans ce cas, ne devrait il pas JUSTEMENT être produit contre l'espèce qu'on cherche à étudier pour se fixer?

Les zones variables de l'anticorps sont donc spécifiques à l'antigène et en l'occurrence ici à l'espèce que l'on cherche à étudier.

Et je sais plus si c'est vraiment indiqué dans le cours mais pourquoi faudrait il que l'anticorps secondaire soit différente de l'anticorps primaire?Que se passe il concrètement si c'est l'anticorps primaire qui soit produit dans la MEME espèce que celle qu'on cherche à étudier et que se passe t'-il si l'anticorps secondaire soit produit chez la même espèce primaire?

Pour que l'anticorps secondaire se fixe sur l'anticorps primaire, il faut qu'il le reconnaisse comme un antigène, or un antigène est une molécule étrangère à un organisme, donc si les deux molécules font parti de la même espèce, il ne le reconnaîtra pas comme un antigène, parce que justement il font parti de la même espèce, donc ce ne peut être une substance externe. Donc, notre expérience n'aboutira pas.
De même que si c'est l'anticorps primaire qui est produit dans la même espèce que la molécule sur laquelle il est censé se fixer, ou l'anticorps secondaire qui est produit chez la même espèce que l'anticorps primaire.
Voila ! J'espère que c'est un petit peu moins flou.
N'hésites pas si tu as d'autres questions.
Bon courage !

[BenC]

Salut,

Merci de m'avoir répondu,

je pense avoir mieux compris mais ce qui me ''dérange'' en soit c'est comment on a su et comment on sait que l'anticorps qu'on introduit à l'intérieur de cellule ou de l'espèce qu'on cherche à étudier? Comme tu l'as dit ''Un anticorps est lui est une protéine produite par l'organisme'' et le fait que ''Les zones variables de l'anticorps sont donc spécifiques à l'antigène et en l'occurrence ici à l'espèce que l'on cherche à étudier.'', étant donné que les AC sont produit PAR l'organisme dans l'immunité, comment a-t'-on fait pour qu'il soit cette fois INTRODUIT dans l'organisme et pas PRODUIT dans l'organisme? Dans notre cas sur le marquage Immunofluorescence, l'espèce qu'on cherche à étudier, elle est considéré comme un antigène mais cette espèce n'est pas justement quelque chose qui fait partie du ''soi'' et pas du ''non soi''?

OU tout simplement, la notion d'AC/Antigène n'est pas exclusive à l'immunité(qui n'est pas abordé dans le programme cette année il me semble) et qu'il peut être utiliser dans d'autres domaines notamment dans celui du marquage immunofluorescence?

[Gregouz]

Salut cher P1, je vais répondre à ta question, mais sache que ce n'est pas un détail important, tu t'en fiches de ça. C'est important de mieux comprendre pour apprendre, mais rien ne sert de pousser la compréhension à l'extrême comme ici, tu peux très bien faire cet exercice sans cette info. Le premier semestre est un semestre court, et approfondir chaque notions vues en cours, même celles sans intérêts, c'est le meilleur moyen de se planter (désolé d'être aussi direct, mais j'ai vu beaucoup de personnes faire cette erreur, et c'est quelque chose qu'il faut vraiment comprendre.

Sinon, dis toi que dans les études de doc et autre, on ne regarde en réalité pas directement dans une espèce, mais on étudie un prélèvement, qui a ensuite été cultivé dans une boite de pétrie ou autre, et donc un nombre restreint de cellules. Les anticorps, eux, sont produits en injectant un antigène dans un animale (exemple: la souris). La souris va produire des anticorps anti-antigène, qu'on va prélever en faisant un prélèvement de sérum chez la souris. Pour obtenir des anticorps secondaires, on injectera le sérum de souris avec les anticorps anti-antigènedans une autre espèce (exemple : chèvre). La chèvre produira alors des anticorps anti-anticorps de souris, qu'on prélèvera en prélevant du sérum de chèvre.

On dépose alors du sérum de souris (avec les anticorps de souris anti-antigène dans la boite de pétrie avec les cellules que tu étudies, et les anticorps s'accrocheront aux antigènes si il y en a. On met ensuite le sérum de chèvre, et les anticorps anti-anticorps de souris s'accrocheront aux anticorps de souris anti-antigène.

Il suffit de rendre les anticorps de chèvre anti-anticorps de souris fluorescent pour faire apparaitre leur localisation (donc la localisation de ce sur quoi ils sont accrochés). Ici les anticorps sont utilisés pour accrocher ce que tu recherches et révéler si il y en a et sa position